金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）菌种是食物中毒的主要来源，并且能够对人体引发各种自限性和致死性疾病。防止病原体污染是确保食品安全行动的关键。广泛采用的菌落培养和计数技术是评估不同样本类型中活细菌数量的标准。然而，传统的平板菌落计数，聚合酶链反应（PCR），核酸为基础的分子生物学，以及酶联免疫吸附试验都存在局限性，往往需要大量的时间和精力，伴随着高昂的成本和对精密仪器的高度依赖。因此，迫切需要快速、可靠和精确的方法来准确筛选和区分致病性食物来源细菌。为了满足这一需求，研究人员正在探索和开发新的技术方法。这些方法通常包括先进的分子生物学技术，如实时定量PCR、数字PCR、基于测序的微生物组分析和生物信息学分析等。这些技术可以快速、准确地检测和鉴定病原体，同时减少对昂贵仪器的依赖和降低操作成本。此外，生物传感器和微流控芯片等设备也正在被开发，以实现更快速、成本效益高的病原体检测。这些新技术的开发和应用将极大地促进食品安全监控，减少食物中毒事件，保障公众健康。

等温核酸扩增方法的出现有效地规避了传统PCR方法所面临的限制，这些限制包括需要大型且昂贵的热循环仪，从而限制了其在资源有限环境下的可行实施。各种等温核酸扩增技术已被用于实时食品安全和环境监测测试。Chao Shi及其合作研究者提出了一种称为链交换扩增（strand exchange amplification, SEA）的创新方法，用于等温检测双链DNA。SEA需要使用简单的引物对，通过连续的链动态来分离双链DNA（dsDNA），而无需热变性。此方法因其成本效益、高效扩增短片段的能力以及能够由技能较低的分析人员可靠实施而区别于其他核酸扩增技术。因此，开发基于SEA的替代方法是核酸检测方法中的一个里程碑，作为PCR的替代品，有望实现快速便捷地识别食源性病原体的目标。

表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering, SERS）已成为一种多功能的先进技术，其显著进展包括：利用低激发功率获取高质量的振动指纹信号、最小化样品损伤以及仅需极低样品体积。基于SERS的葡萄球菌传感器已在文献中有所记载。本研究将首次尝试将SERS与SEA结合，以实现葡萄球菌的快速、经济且特异性的选择。然而，这种整合的成功实施依赖于两个关键方面：SERS基底的选择和输出信号的数字化表达。首先，SERS的性能显著受到贵金属纳米结构的大小和形状的影响。为了提高SERS基底上热点密度和强度的增强，已投入大量努力，尤其是在具有尖锐角或纳米间隙的基底上。在这方面，金属纳米花由于其显著的曲率和电磁场增强的贡献，相较于球形纳米颗粒，表现出显著的电磁场强化特性。此外，固相SERS基底提供了优越的稳定性和可重复性，更适合实时检测场景。对于后者，SERS-SEA的定量分析机制依赖于指纹信号特征峰的强度与葡萄球菌浓度的相关性。然而，由于潜在的不期望或干扰变量，在从食品样品采集光谱时可能会出现挑战。通过集成机器学习工具来提高传感效率，以最小化干扰变量并实现卓越的预测性能。

因此，本文建立了一种新颖的波长选择型机器学习驱动的双金属纳米花基放大表面增强拉曼散射系统，用于食品样品中金黄色葡萄球菌的快速和便携式检测。所提出的平台的示意图工作流程如图1所示：i）使用SEA作为特异性提取工具，对金黄色葡萄球菌的nuc靶基因（nuc T′）进行放大；ii）合成了一种阳极氧化铝（AAO）过滤膜支撑的金和银双金属纳米花（Au/Ag FL@AAO）SERS纳米基底，以在传感系统中提供稳定的增强信号输出；iii）将4-ATP浸涂在Au/Ag FL@AAO纳米基底表面，以通过SEA主动捕获由SEA弱酸水解放大的nuc T′；iv）使用偏最小二乘（PLS）、区间组合群分析-偏最小二乘（ICPA-PLS）和自助软截断（BOSS-PLS）的机器学习工具建立高性能预测模型，去除非特异性结合的目标背景信号，并最终v）将所提生物传感器应用于食品样本中金黄色葡萄球菌的检测和验证。据我们所知，本文首次尝试将Au/Ag FL@AAO-4-ATP基SERS纳米基底、SEA和波长选择型机器学习工具整合用于金黄色葡萄球菌的分析，并可能作为一种快速且成本效益高的策略，用于特定识别和量化真实样本中的病原菌。

首先，对Au/Ag FL@AAO-4-ATP纳米基底进行表征。透射电子显微镜（TEM）表征证实了Au/Ag花状纳米结构FL的形貌。观测到的粒径小于100 nm。能谱元素分析（EDS）表明Au/Ag FL中同时存在Ag和Au成分。选区电子衍射（SAED）结果证实了Au/Ag FL的多晶结构。紫外-可见光谱在660 nm附近呈现明显的吸收峰。Au/Ag FL负载于AAO薄膜上的形貌通过扫描电子显微镜（SEM）表征显示为致密堆积表面。EDS元素组成分析证实了样品中存在Ag和Au。EDS面扫描分析进一步证实了Au/Ag FL在AAO基底上的均匀分布。通过SEM分析确定了Au/Ag FL的最佳负载量。结果表明，在80.0 μL负载体积下，AAO基底上呈现致密的Au/Ag FL分布（图1A–D）。使用4-ATP作为信号探针测得的SERS信号强度也在此负载量下达到最高（图1E–G）。

图1 在AAO膜上Au/Ag FL的最佳体积（A-D）和相应的SERS结果（E-G）。

经4-ATP信号探针浸润后，Au/Ag FL@AAO的SEM形貌未发生变化（图2A）。EDS元素分析表明，Au/Ag FL@AAO-4-ATP复合体系中存在Au、Ag、N和S元素，其中氮和硫元素来源于4-ATP（图2B）。EDS面扫描图像直观地展示了N和S元素在基底表面的均匀分布（图2C–G），这突显了Au/Ag FL@AAO-4-ATP基底的强均质性和稳定性（图2H）。既往研究表明了多种制备AAO负载型SERS基底的方法。例如，采用自组装方法将银纳米粒子沉积于AAO膜的表面制备SERS基底。或者采用浸渍技术，将AAO膜浸入王水中直接在膜上生长金纳米粒子簇。相比之下，本研究采用真空辅助沉积技术制备SERS基底。该方法的若干优势在于：首先，真空辅助技术确保纳米花朵的均匀沉积，避免了"滴干"法或浸渍法中常见的团聚问题。其次，Au/Ag纳米花朵独特的花状形貌提供了比简单纳米粒子或簇更大的活性表面积和更强的电磁场增强效果。第三，制备的Au/Ag FL纳米基底具有高稳定性和可重复性，这对于在牛奶等复杂样品中进行准确SERS测量至关重要。

图2 SEM(A), EDS (B), EDS mapping (C–G) and Raman mapping (H)Au/Ag FL@AAO-4-ATP纳米基底的表征的结果。

接下来，验证波长选择性ICPA-PLS模型结果。ICPA方法进一步应用于阐明其适用范围。本模型采用二进制矩阵采样（BMS）技术，随机组合光谱的波长子区间，以生成相应的PLS校正模型。模型种群分析（MPA）用于评估这些模型，并采用指数衰减函数（EDF）消除对贡献较小的子区间，以实现空间收缩。经过多次迭代，确定了最佳波长区间，以确定最小的RMSECV。ICPA方法用于筛选与Au/Ag FL@AAO-4-ATP SERS传感结合PLS定量分析金黄色葡萄球菌浓度相关的显著变量。对于全光谱，在1135-1165 cm⁻¹、1181-1248 cm⁻¹和1560-1587 cm⁻¹区间内，从总共752个变量中筛选出108个变量（图3A）。获得的结果为Rc = 0.9693，RMSECV = 0.42，Rp = 0.9556和RMSEP = 0.51（图3B）。对于特征光谱，BOSS-PLS模型在五个区间内筛选出82个相关变量，分别为718–727、1203–1226、1301–1330、1350–1379和1555–1635，从总共312个变量中筛选出（图3C）。模型结果为Rc = 0.9655，RMSECV = 0.445，Rp = 0.9626和RMSEP = 0.466（图3D）。

图3 (A) 应基于完整光谱选择的变量；(B) 基于完整光谱的ICPA-PLS模型的校准集和预测集；(C) 基于特征光谱选择的变量；(D) 基于特征光谱的ICPA-PLS模型的校准集和预测集。

本研究基于完整且全面的谱变量，对三种定量模型进行了比较评估，如表1所示。模型的预测性能通过Rc、RMSECV、Rp、RMSEP和RPD等评估指标进行衡量。ICPA-PLS模型在这些指标上表现出更高的预测性能。该模型对完整谱和特征谱的定量分析分别获得了RPD值3.3024和3.5583，证实了其预测能力。与其他模型相比，PLS模型的性能相对较低，这可能与建模数据中无关变量的高发生率以及依赖完整谱有关。相比之下，BOSS-PLS模型通过筛选特征变量提升了模型的预测能力。然而，BOSS方法忽略了连续变量之间的高相关性，可能导致在引导抽样过程中遗漏特征细节。

综上所述，本工作报道了一种创新的基于机器学习的波长选择自适应SEA/SERS生物传感器，用于检测牛奶中金黄色葡萄球菌特异性基因。合成的Au/Ag FL@AAO/4-ATP基SERS纳米底物被用作集成SEA检测和波长选择机器学习工具的SERS基底。通过SEA检测实现了金黄色葡萄球菌nuc T′基因的特异性扩增。扩增的DNA片段通过亲核加成反应与Au/Ag FL@AAO-4-ATP纳米芯片捕获。收集的SERS指纹信号使用三种不同的深度学习识别方法（PLS、BOSS-PLS和ICPA-PLS）进行分析与比较。ICPA-PLS模型比其他模型表现出更优越的预测性能；值得注意的是，使用特征谱图的定量分析模型比全谱图模型表现更好。所提出的方法验证结果在10至10⁶ cfu/mL范围内的预测相关系数为0.948，低于P=0.05时的临界t值。所提出的SERS/SEA/机器学习集成平台研究为在真实样品中快速简便地检测金黄色葡萄球菌提供了一个新途径，并展示了在简单条件下进行的高灵活性检测能力，与需要精确温度控制和热循环步骤的PCR相比。该研究为确保食品和环境安全而推进SEA/SERS生物分析提供了新的视角。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117363

来源：微生物安全与健康网，作者~段子璇。