基于RT-LAMP/CRISPR Cas12a的诺如病毒检测方法研究
发布时间：2025-06-06 浏览次数：342 分享：
在食品安全领域，病毒污染一直是全球关注的焦点。诺如病毒，作为一种极具传染性的病原体，是导致全球约18%腹泻病例的主要原因之一。它具有低感染剂量、快速发作和强大的传播能力，给公共卫生带来了巨大挑战。然而，传统的检测方法依赖于昂贵的设备和复杂的操作流程，难以满足快速、现场检测的需求。最近，一项结合了CRISPR技术与逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）的创新检测方法，为这一难题带来了新的解决方案。
诺如病毒：食品安全的重大威胁
诺如病毒是一种单股正链RNA病毒，属于杯状病毒科。其基因组包含三个开放阅读框（ORFs），其中ORF1编码六种非结构蛋白，ORF2和ORF3分别编码两种结构蛋白VP1和VP2。该病毒在全球范围内广泛分布，尤其在医院、学校和邮轮等人员密集场所，一旦暴发，极易引发大规模感染。据统计，仅在美国，每年就有约2100万人感染诺如病毒，其中超过70000人需要住院治疗，超过800人死亡。在中国，诺如病毒也是导致食源性疾病的重要因素之一，给社会经济带来了沉重负担。
传统检测方法的局限性
目前，检测诺如病毒的方法主要包括免疫学检测、核酸扩增技术（如PCR和qPCR）以及基因测序等。然而，这些方法存在一些局限性。免疫学方法操作相对简单，但特异性差，对病毒变异适应性弱，灵敏度低，易产生假阳性和假阴性结果。qPCR虽灵敏度高，但设备昂贵、操作复杂，对温度控制要求高，检测时间长，难以在基层和现场应用。此外，这些方法对食品基质干扰敏感，成本较高，难以满足现场快速检测需求。这些局限性限制了传统方法在实际应用中的广泛推广，特别是在资源有限的地区。
CRISPR/Cas12技术：为病毒检测带来新曙光
CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）技术近年来在生物医学领域取得了重大突破，其在分子诊断中的应用尤其引人注目。CRISPR/Cas系统由引导RNA（gRNA）、CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）和目标序列组成，当gRNA与目标序列匹配时，会激活Cas蛋白的切割活性，进而产生可检测的信号。这种技术具有高度的特异性和灵敏度，能够精准识别目标核酸序列，为病毒检测提供了新的思路和方法。
在这项研究中，研究人员将逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术与CRISPR/Cas12技术相结合，开发出一种快速、灵敏的诺如病毒检测方法。RT-LAMP技术能够在较短时间内完成核酸扩增，而CRISPR/Cas12技术则进一步提高了检测的特异性和灵敏度。这种组合方法不仅操作简便，而且对设备要求低，适合在基层检测机构和现场快速检测中应用。
图1 逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）/ CRISPR/Cas12a 方法检测诺如病毒（NOV）的示意图。
检测方法的优势与创新
研究人员开发的RT-LAMP/CRISPR Cas12a检测系统具有多项显著优势。首先，该系统仅需两个反应温度，整个检测过程可在60分钟内完成，大大缩短了检测时间。其次，该方法对不同食品基质的干扰具有较强的抵抗力，能够准确检测出被诺如病毒污染的食品样本。此外，该检测系统还具有较高的灵敏度和特异性，对于诺如病毒GI和GII的检测灵敏度分别达到32.8拷贝/反应和22.8拷贝/反应。这意味着即使在病毒含量较低的情况下，也能够及时发现污染，从而有效防止病毒的进一步传播。
图2 逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）/CRISPR/Cas12a 的特异性和灵敏度。所有数值均为平均值 ± 标准差（SD），重复次数(n=6)。（a）诺如病毒（NOV）GI 型的检测范围；（b）NOV GII 型的检测范围；（c）NOV GI 型的特异性；（d）NOV GII 型的特异性。Fl 为荧光。
实验验证与应用前景
为了验证该检测方法的有效性，研究人员进行了大量实验。他们选择了三种不同的食品样本：生蔬菜、胡萝卜和蛤蜊，并人为添加了已知浓度的诺如病毒RNA。实验结果表明，RT-LAMP/CRISPR Cas12a系统能够准确检测出所有阳性样本，且未在未污染的对照样本中检测到信号。这表明该方法具有较高的稳定性和可靠性，能够满足实际检测需求。
此外，该检测系统还具有一定的通用性，通过简单更换引物和gRNA，可以针对其他核酸目标进行检测。这意味着该技术不仅可以用于诺如病毒的检测，还可以扩展到其他食源性病毒的检测，为食品安全检测提供了一个强大的工具。
图3 逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）/ CRISPR/Cas12a 检测人工污染食品样本的结果。顶部为逆转录定量实时 PCR（RT-qPCR）的 Ct 值，热图显示荧光强度，底部为人工 RNA 靶标的数量。（a）为诺如病毒（NOV）GI 型的检测结果，（b）为 NOV GII 型的检测结果。
未来展望
这项研究的成功不仅为诺如病毒的快速检测提供了一种新的技术手段，也为其他食源性病毒的检测开辟了新的思路。通过简单地更换引物和crRNA，该检测平台可以轻松扩展到其他病毒的检测，具有很强的通用性和灵活性。此外，该方法还可以与小型化、便携式的检测设备结合，进一步提高其在资源有限地区的应用价值。
参考文献：Gou S, Liu Y, Li Q, et al. CRISPR/Cas12‐mediated detection of GI and GII Norovirus in different food samples[J]. Journal of Food Science, 2025, 90(3): e70160.
来源：微生物安全与健康网，作者~蔡伟程。
